PCR ce este

reacție în lanț a polimerazei (PCR. PCR) a inventat în 1983, Keri Myullis (om de știință american). Ulterior, el a primit o invenție Premiul Nobel. In prezent, diagnosticare PCR este una dintre metodele cele mai exacte și sensibile pentru diagnosticul bolilor infectioase.

reacție în lanț a polimerazei (PCR) - metoda experimentala de biologie moleculară, metoda în creștere semnificativă a concentrației unor mici fragmente de acid nucleic (ADN) în materialul biologic (proba).

De asemenea, o simplă creștere a numărului de copii de ADN (acest proces se numește amplificare), PCR permite multe alte manipulare a materialului genetic (introducerea de mutații, fragmente ADN despicare), și este utilizat pe scară largă în practica biologică și medicală, de exemplu, pentru diagnostic (genetice, infecțioase) pentru paternitate, pentru clonarea genei, introducerea de mutații izolarea genelor noi.

Specificitatea și aplicarea

PCR - metoda de diagnostic molecular pentru o serie de infectii devin „standard de aur“ testul timpului și atent testate clinic. Metoda PCR pentru a determina prezența agentului cauzal, chiar dacă eșantionul conține doar câteva molecule de ADN ale patogenului.

PCR permite diagnosticarea prezenței unei agenții patogeni lungi în creștere, fără a recurge la metode microbiologice consumatoare de timp, care este deosebit de important in ginecologie si urologie în diagnosticul infecțiilor urogenitale, infecții cu transmitere sexuală (ITS).

De asemenea, această metodă se efectuează diagnosticul infecțiilor virale. cum ar fi hepatita. HIV și altele. Sensibilitatea metodei este semnificativ superioară celei în metodele immunohomicheskih și microbiologice, precum și principiul metodei pentru diagnosticarea prezenței infecției cu o variație antigenică semnificativă.

Specificitatea PCR folosind tehnologia PCR chiar și pentru toate virus, chlamydia, mycoplasma, ureaplasma, și cele mai multe alte infecții bacteriene ajunge la 100%. Metoda PCR poate detecta chiar si celulele singulare de bacterii sau virusuri. diagnosticare PCR detectează prezența agenților infecțioși, în cazurile în care alte metode (imunologice, bacteriologic, microscopice) nu se poate face acest lucru.

Metoda PCR este deosebit de eficient pentru diagnostic dificil formele de cultură, neinstruiți și ascunse ale microorganismelor existente, care sunt frecvent întâlnite în infecțiile latente și cronice, deoarece această metodă evită dificultățile asociate cu cultivarea acestor microorganisme in vitro.

Utilizarea de diagnosticare PCR, de asemenea, foarte eficiente împotriva agenților patogeni cu variabilitate antigenică ridicată și paraziți intracelulari. detecție PCR este posibilă nu numai patogeni din materialul clinic obtinut de la pacient, ci și materiale derivate din obiectele mediului (apă, sol și așa mai departe. D.). În practica urologice și ginecologice - pentru detectarea Chlamydia, ureaplasmosis. gonoreea, herpesul, gardnerelloza, infectia cu Mycoplasma, HPV - papilomavirus uman; în pneumologie - pentru diagnosticul diferențial al pneumoniei virale și bacteriene, tuberculoza; în gastroenterologie - pentru a identifica helikobakterioza; boli infecțioase în clinica - ca o metodă rapidă de diagnostic de salmonella, difterie, hepatita B, C și G; în hematologie - pentru a detecta infecția cu CMV, Oncoviruses.

Specificitatea PCR se bazează pe formarea de complecși între matriță și primerii complementare - oligonucleotide sintetice scurte cu o lungime de 18 - 30 litere. Fiecare dintre primeri comparabile (complementare), cu un singur fir de șablon dublu catenară, care flanchează începutul și sfârșitul porțiunii amplificate.

După compusul (hibridizare) cu primer matriță (recoacere), acesta din urmă servește ca un primer pentru ADN polimerază în timpul sintezei șablonului catene complementare.

Pentru PCR necesită următoarele componente, în cel mai simplu caz:

• Șablonul ADN care conține regiunea de ADN care este necesară pentru a amplifica;
• Doi primeri complementari la capetele dorite ale fragmentului;
• ADN polimerază termostabilă;
• deoxinucleotid trifosfați (A, G, C, T);
• ioni de Mg2 +, necesar pentru polimerază;
• soluție tampon.

PCR a fost realizată într-un aparat de termocicluri - dispozitive oferind tuburi de răcire și încălzire intermitentă, de obicei, cu o precizie de cel puțin 0,1 ° C Pentru a preveni evaporarea amestecului de reacție a fost adăugat în tub un ulei cu punct de fierbere ridicat, cum ar fi parafina lichidă. Adăugarea de enzime spetsifichekih poate crește randamentul unei reacții PCR.

In mod normal, atunci când PCR se realizează 20 - 35 de cicluri, fiecare constând din trei etape. Dublu catenar matriță de ADN a fost încălzit la 94-96 ° C (sau până la 98 ° C, în special atunci când se utilizează o polimerază termostabilă) 0,5 - 2 minute catenă de ADN dispersat. Această etapă se numește Denaturarea - rupe legăturile de hidrogen între cele două circuite. Uneori, înainte de primul ciclu se efectuează preîncălzirea amestecului de reacție timp de 2 - 5 minute pentru Denaturarea completă a șablon și primeri.

Când lanțul rupt, temperatura a fost coborâtă la primeri intra în contact cu șablonul monocatenare. Această etapă se numește recoacere. Temperatura de recoacere depinde de primeri și selectați în general pentru 4 - 5 ° C sub temperatura lor de topire. Pasul de timp - 0,5 - 2 minute.

ADN polimerază reproduce un circuit de matrice folosind un primer ca primer. Aceasta - etapa de alungire. Temperatura de alungire depinde de polimerază. utilizate frecvent polimerază cel mai activ la 72 ° C timpul de alungire depinde atât de tipul de ADN polimerazei, iar lungimea fragmentului amplificat. De obicei, timpul de elongare trebuie să fie egală cu un minut pentru fiecare mie de perechi de baze. După finalizarea tuturor ciclurilor este adesea efectuată o etapă suplimentară a alungirii finale pentru a termina toate fragmentele monocatenare. Acest pas durează timp de 10 - 15 min.

Pregătirea materialului pentru cercetare și transportul la laborator

Pentru succesul analizei este important să se colecteze în mod corespunzător materialul de la pacient și să efectueze formarea sa în mod corespunzător. Este cunoscut faptul că, în cele mai multe erori de diagnostic de laborator (până la 70%) se realizează pe treapta de preparare a probei. Pentru sânge în vitro de laborator sunt utilizate în prezent sisteme de vid, care pe de o parte, cel puțin răni pacientul, dar pe de altă parte - poate face un material de captare în așa fel încât să nu se află în contact cu nici personal, nici mediul înconjurător. Aceasta evită contaminarea (contaminarea) a materialului și asigură analiza PCR obiectivitate.

ADN - acidul dezoxiribonucleic - polimer biologic, unul dintre cele două tipuri de acizi nucleici, asigură depozitarea, transmiterea de la o generație la alta și de realizare a programului genetic de dezvoltare și funcționare a organismelor vii. Rolul principal al ADN-ului în celule - stocarea pe termen lung a informațiilor despre structura ARN-ului și a proteinelor.

ARN - acid ribonucleic - polimer biologic, aproape în structura chimică a ADN-ului. Molecula de ARN construită din aceleași unități monomer - nucleotide ca ADN-ul. In natura, ARN, există, de obicei, ca un singur lanț. Unele ARN viral este purtătorul informației genetice. În celulă, joacă un rol important în transmiterea informațiilor de la ADN la proteine. ARN-ul a fost sintetizat pe un șablon ADN. Acest proces se numește transcriere. ADN-ul are zone în care informația responsabilă de sinteza a trei tipuri de ARN care diferă prin funcție: informații sau ARN mesager (ARNm), ribozomal (ARNr) și de transport (ARNt). Toate cele trei tipuri de ARN într-un fel implicat în sinteza proteinelor. Cu toate acestea, informațiile privind sinteza proteinelor se găsește numai în mARN.

Nucleotidele - unitate repetitivă de bază în molecule de acizi nucleici, compuși chimici produs bază azotată, un zahar cu cinci carbon (pentozo) și una sau mai multe grupări fosfat. Nucleotidele prezentate în acizi nucleici, conțin o grupare fosfat. Ele sunt numite în ele conțin baze azotate - adenina (A), conținând adenină, guanină (G) - guanină, citozină (C) - citozină, timină (T) - timină, uracil (U) - uracil. Compoziția include 4 tip nucleotidice ADN - A, T, G, C, de tip ARN bine 4 - A, U, G, C. Zahăr compus din toate ADN-ul este de nucleotide cu dezoxiriboză, ARN - riboză. In formarea acizilor nucleici, nucleotide, prin legarea pentru a forma o coloana vertebrala de zahar-fosfat a moleculei, pe de o parte, care sunt o bază.

Primer - ADN-ul kotrotkaya utilizat pentru replicarea catenei șablon. Fiecare dintre primeri este complementară cu fir de șablon dublu catenar, care flanchează începutul și sfârșitul porțiunii amplificate.

literatură